1.介绍
2.合成
3.常识
4.PNA设计
5.应用
6.订购

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1.介绍
肽核酸(PNA, peptide nucleic acid)是一种全新的DNA类似物，于1991年由Dr.Nielsen, Dr.Egholm,Dr.Berg,和Dr.Buchardt发明。该分子的特点是以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

 

 

2.合成

作为世界上唯一一家专注于PNA合成服务的公司，Panagene采用专利技术生产的单体Bts PNA monomers为原料 (Bts ; benzothiazole-2-sulfonyl group)，以及世界领先的多肽聚合专利技术。和其他公司采用的合成方法，例如Boc-或Fmoc-方法相比，Panagene公司的Bts技术的优点有：

• 合成简单
• 合成费用低
• 产量高
• 纯度高

Bts和其他单体相比，其优点有：

	Panagene PNA (Bts单体)	Other PNA (Fmoc单体)
单体价格（Cost of monomer production）	低	高
大规模单体合成（Large scale synthesis of monomers）	好	-
单体溶解度（Solubility of monomers）	好	一般
单体的稳定性能（Stability of monomers in solution）	好	差
寡聚体合成费用（Cost of oligomer synthesis）	低	高
寡聚体合成溶剂（Solvent for oligomer synthesis (Anhydrous requirement)）	不需要DMF	必须使用NMP
聚合试剂（Coupling reagent）	无	HATU
单体是否需要预先活化（Pre-activation of monomers）	不	是
去保护时转酰基作用 （Transacylation during deprotection）	+	++++++
单体和转酰基反应后产物的反应 （Reactivity of monomer with transacylated product）	少	多
单体是否可以重复使用（Reuse of monomers）	是	不能

请点击这里了解详细的合成方法（文件一， 文件二）

3.PNA常识

溶解性（Solubility)。PNA通常很容易在水中溶解（可达几百uM)。但是一些特殊的序列或者经过修饰的PNA，会出现溶解性降低的现象。此时需要参照以下的方法：

• 在60°C中加热大约10分钟。
• 加入0.1% TFA或者10-20%的acetonitrile，或者其他的有机溶剂，例如（DMF,NMP等）。

保存（Storage)。虽然PNA在常温下非常稳定，但是我们还是建议将PNA在4°C中保存。

• 100nmol的PNA一般很容易在1-2毫升的水中溶解。
• 我们建议分装一下。每个分装后的PNA可以在每次使用前稀释在适当的缓冲液中。
• 如果需要在零下20度长时间保存的话，请将PNA冻干保存。
• 也可以将PNA溶解后在零下20度长期保存，而不会对PNA的效用有任何的影响。这种方法特别适用于嘌呤含量高的短PNA。
• 我们建议用聚丙烯或者聚乙烯的试管来保存PNA，而不是使用玻璃或者聚苯乙烯的管子。

缓冲液选择

• 用于DNA。PNA/DNA杂交体的Tm和离子强度没有关系，因此，即使在较低的离子浓度下，PNA也可以非常有效地结合到DNA。
• 如果用于RNA,低盐条件会有助于RNA三级结构变性，从而使得PNA更容易和RNA杂交。

PNA和DNA的比较

	PNA	DNA
与DNA杂交的亲和性	At least 1 ℃ higher per base	-
与DNA杂交速度	100 - 5000 times faster	-
杂交时对盐浓度的要求	Independent	Dependent
每个错配碱基的Tm	Lowering 15℃	Lowering 10℃
化学稳定性	Stable	Unstable or moderate
生物稳定性	Stable to nuclease and protease	Degradation by nuclease
温度稳定性	Good	Moderate
水中稳定性	Restricted solubility enhanced by use of appropriate linkers	Soluble
诊断目的用途的探针长度	13 - 18 bases	20-30 bases

4.PNA设计

请遵循以下原则来设计PNA片段：

• 结合特性。虽然从理论上讲，PNA可以从两个方向来和目的片段形成杂交体，但实际上，最常见的是反向结合（ anti-parallel orientation）。PNA的N末端相当于寡核苷酸的5’端，因此也经常被称为PNA的5’端。和普通的DNA/DNA杂交体相比较，PNA/DNA具有较高的Tm值。一般而言，在100mM NaCl的条件下，每个碱基对的Tm值会升高大约1°C。
• 长度。由于PNA具有很高的亲和力（higher affinity），因此不需要设计很长的序列，一般而言12-18个已经足以满足需要，这和其他常规25-40个寡核苷酸探针有着巨大的区别。我们必须要记得，序列越短，则其特异性就越高。对PNA而言，有时更短的序列也会达到预期的效果。反而长的PNA会发生聚集沉淀（aggregate），而影响下游的纯化和分析。
• 嘌呤含量。嘌呤含量高的PNA，特别是鸟嘌呤G,也容易发生聚集沉淀（aggregate）。所以，在任何10个连续的PNA单体中，不要有7个或者更多的嘌呤出现。因此，从这意义上讲，越短的PNA序列，那么就越不需要担心设计上出现问题。
• 自身互补。尽量来防止自身互补（Self-complementarity）的发生。在序列设计上，避免反向重复（inverse repeats），发夹结构（hairpin forming），和回文序列（palindromic sequences）。

欲了解更多PNA文献，请点击这里

欲了解更过PNA合成和终产物问题，请点击这里

欲了解PNA的连接序列（Linker)，间隔序列（Spacer)，以及其他修饰，请点击这里

 

5.应用 鉴于上述诸多DNA分子不具备的优点，近十年来，人们为其在许多高技术领域找到了用途。

其主要应用有：

1. miRNA抑制剂（miRNA inhibitor) （请点击这里，了解更多抑制剂信息）
   1. Fabani MM et al. 2008. miR-122 targeting with LNA/2’-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA 14(2), 336-346.
   2. Mack GS. 2007. MicroRNA gets down to business. Nat Biotechnol. 25(6), 631-8. Review.
   3. Dalmay T. 2008. MicroRNAs and cancer. J Intern Med. 263(4), 366-75.
   4. Hammond SM. et al. 2006. MicroRNAs as oncogenes. Curr Opin Genet Dev. 16(1), 4-9. Review.
2. 反义药物研究和治疗领域
   1. Jens Kurreck, 2003. Antisense technologies; Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644.
   2. Uffe Koppelhus et al. Cellular delivery of peptide nucleic acid (PNA). Advanced Drug Delivery Reviews 55, 267-280.
3. 分子生物和功能基因组学的工具

例如Northern/Southern blot:

1. Nielsen PE et al. 1999. An introduction to peptide nucleic acid. Curr Issues Mol Biol. 1, 89-104.
2. Perry-O’Keefe et al. 1996. Peptide nucleic acid pre-gel hybridization: an alternative to Southern hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14670-14675.
3. Adriana Tovar-Salazar et al. 2007. Preparation of radioiodinated peptide nucleic acids with high specific activity. Analytical Biochemistry 360, 92-98.

PCR clamping:

1. Henrik Ørum. 1999. PCR Clamping; Peptide nucleic acids (protocols and Applications). Horizon Scientific Press. 193-200.
2. Henrik Ørum et al. 1993. Single base pair mutation analysis by PNA directed PCR clamping. Nucleic Acids Res. 21, 5332-5336.

Enhanced PCR amplification:

1. Demers DB et al. 1995. Enhanced PCR amplification of VNTR locus D1S80 using peptide nucleic acid (PNA). Nucleic Acids Res.23, 3050-3055.

Artificial restriction enzyme systems:

1. Demidov V. et al. 1993. Sequence specific double strand DNA cleavage by peptide nucleic acid (PNA) targeting using nuclease S1.Nucleic Acids Res. 21, 2103-2107.
2. Kuhn Heiko et al. 2003. Artificial Site-Specific DNA-Nicking System Based on Common Restriction Enzymes Assisted by PNA Openers. Biochemistry 42, 4985-4992.

PNA-assisted rare cleavage:

1. Alexei G. Veselkov et al. 1996. PNA as a rare genome-cutter. Nature 379, 214.
2. Alexei G. Veselkov et al. 1996. A new class of genome rare cutters. Nucleic Acids Res. 24, 2483-2488.

DNA purification:

1. Henrik Ørum et al. 1995. Sequence specific purification of nucleic acids by PNA-controlled hybrid selection. Biotechniques 19, 472-479.
2. Seeger C et al. 1997. PNA-mediated purification of PCR amplifiable human genomic DNA from whole blood. Biotechniques 23, 512-517.
3. Darrell P. et al. 2000. Affinity Purification of DNA and RNA from Environmental Samples with Peptide Nucleic Acid Clamps. Applied and Environmental Microbilogy 66(8), 3438-3445

4. 诊断用分子探针

测定telomere的FISH探针:

1. Kentaro Taemura et al. 2005. Dynamic rearrangement of telomeres during spermatogenesis in mice. Developmental Biology 281, 196-207.
2. Won-Woo Lee et al. 2002. Age-related telomere length dynamics in peripheral blood mononuclear cells of healthy cynomolgus monkeys measured by Flow FISH. Immunology 105, 458-465.
3. Heather Perry. et al. 2001. Identification of indicator microorganisms using a standardized PNA FISH method. Journal of Microbiological Methods 47, 281-292.
4. Caifu Chen et al. 1999. Single base discrimination of CENP-B repeats on mouse and human chromosomes with PNA-FISH. Mammalian Genome 10, 13-18.
5. M. Hultdin et al. 1998. Telomere analysis by flourescence in situ hybridization and flow cytometry. Nucleic Acids Research 26(16), 3651-3656.
6. Peter M. Landsdorp et al. 1996. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Human Molecular Genetics 5(5), 685-691.

Lightup探针:

1. Svanvik N et al. 2000. Light-up probes: thiazole orange-conjugated peptide nucleic acid for detection of target nucleic acid in homogeneous solution. Anal. Biochem. 281, 26 -35.
2. Svanvik N et al. 2000. Detection of PCR products in real-time using light-up probes. Anal. Biochem. 287, 179-82.

SNP鉴定探针:

1. Petersen KA. et al. 2004. Short PNA molecular beacons for real-time PCR allelic discrimination of single nucleotide polymorphisms. Mololecular and Cellular Probes 18, 117-122.
2. Ren B. et al. 2004. High-throughput SNP genotyping by combining exonuclease III, nuclease S1, and acridine-bearing PNA. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf) 48, 183-4.
3. Ye S. et al. 2002. Detection of single nucleotide polymorphisms by the combination of nuclease S1 and PNA. Nucleic Acids Res Suppl. 2, 235-6.
4. Rockenbauer E. et al. 2005. SNP Genotyping Using Microsphere-Linked PNA and Flow Cytometric Detection. Cytometry A 64(2),80-86.

Microarray探针:

1. Liu ZC. et al. 2007. Light-directed synthesis of peptide nucleic acids (PNAs) chips. Biosensors and Bioelectronics 22, 2891-2897.
2. Raymond FR et al. 2005. Detection of target DNA using fluorescent cationic polymer and peptide nucleic acid probes on solid support. BMC Biotechnol. 5:10.
3. Brandt O. et al. 2003. PNA microarrays for hybridization of unlabelled DNA samples. Nucleic Acids Res. 31(19), e119.
4. Liu CG et al. 2004. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(26), 9740-9744.

Nucleic acid biosensor探针:

1. Wang J. et al. 1998. DNA biosensors based on Peptide Nucleic Acid (PNA) recognition layers.A review. Biosensors & Bioelectronics 13, 757-762.
2. Ray A et al. 2000. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future. The FASEB Journal 14, 1041-1060.
3. Demidov V. et al. 2003. PNA and LNA throw light on DNA. Trends in Biotechnology 21(1), 4-7.

6.订购  请和吉奥联系来探讨具体的合作事宜。  

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